摘 要

摘　要：為查明煤發酵制生物氫和甲烷，以及連續發酵產氫產甲烷的最佳產氣條件，以河南省鶴壁四礦的瘦煤為發酵底物，分別利用自主研發的產氫培養基和產甲烷培養基富集地層水中的混合

摘　要：為查明煤發酵制生物氫和甲烷，以及連續發酵產氫產甲烷的最佳產氣條件，以河南省鶴壁四礦的瘦煤為發酵底物，分別利用自主研發的產氫培養基和產甲烷培養基富集地層水中的混合菌群，并以其為接種物，分析了在不同條件下生物氫氣和生物甲烷的生成量，并利用發酵產氫后的廢料為基底，使用不同方法進行處理，研究了生物甲烷的生成量。實驗結果表明：①發酵產氫最適宜的初始pH值在6.0左右；②金屬離子絡合劑EDTA二鈉可顯著提高氫氣產率，當EDTA二鈉濃度為2.0g／L時，氫氣產率達到最大值；③產甲烷發酵時，將白腐菌液和富集培養后的地層水菌液同時作為接種物時的甲烷產率最高；④向產氫后的廢料中補加堿液以及新鮮地層水，均可實現廢料再生甲烷，且直接補堿液時的甲烷產率更高；⑤相比于單獨發酵產甲烷工藝，連續產氫產甲烷工藝可獲得更高的甲烷濃度和甲烷產率。該成果為微生物采煤技術提供了實驗依據。

關鍵詞：瘦煤  厭氧發酵  氫氣  甲烷  EDTA二鈉  接種物  產氣率  連續發酵  微生物采煤

An experimental study of hydrogen and methane production from fermentation of coal

Abstract：To investigate the optimal gas-produced conditions for independent fermentation of coals producing hydrogen and methane and the continuous fermentation of hydrogen and methane，samples from the Hebi No.4 colliery were utilized as coal substrates，and specific media prepared in advance in laboratory for the production of hydrogen and methane respectively were used as inocula after the enrichment of mixed strain in stratum water，and the content of produced hydrogen and methane under various conditions were further examined．After that，the waste of fermentative hydrogen production was applied as substrates to investigate the production of methane with different pre-treatments．The results showed that the optimal initial pH value for fermentative hydrogen production was around 6.0；the disodium EDTA was able to significantly increase the hydrogen production which reached a maximum when the disodium EDTA was added at 2.0 g／L：the mixture of white-rot fungi and enriched strain in stratum water was the optimal inoculum for a highest production of methane；a reproduction of methane was achieved by the addition of alkali liquor and fresh stratum water in the waste of fermentative hydrogen production，and was in a comparatively higher production rate when the alkali liquor was directly added；and the continuous fermentation obtained a better methane production as compared with the independent methane fermentation．This experimental study provides a reference for the research of microbial biomass methane production following coal mining．

Keywords：lean coal，anaerobic condition，hydrogen，methane，disodium EDTA，inoculum，gas production rate，continuous fermentation，microbial biomass methane production，coal mining

目前的能源消費結構以煤、石油、天然氣等一次性化石燃料為主，但隨著經濟的高速發展，化石燃料的儲量銳減，且一次性化石燃料在燃燒過程中會產生大量溫室氣體，對環境造成不利影響。因此，人們正努力尋求一種清潔高效新能源，以代替化石能源的過度消耗。

伴隨著以甲烷為主要成分的煤層生物氣藏在世界各地的不斷發現，學者們開始通過實驗模擬研究煤層生物甲烷形成的條件和機理^[1-4]，以期實現煤制生物氣這一采殘煤工藝。近20年來，我國一批學者研究了煤層生物氣的形成過程^[5-13]，但至今仍停留在利用煤制取生物甲烷這一階段。近期筆者的研究表明，在一定的條件下微生物還可以降解煤炭生成氫氣^[14]。相比于甲烷，氫氣的熱值更高而且其燃燒產物只有水，對環境無任何污染。因此煤制生物氫氣技術很有可能成為未來煤層氣生物工程領域的主要發展方向。

筆者利用本源混合菌群，即煤礦生產過程中產生的地層水為接種物，對煤制生物氫氣、煤制生物甲烷的最適發酵條件進行了研究，并且對產氫后再產甲烷的工藝條件進行了初步探索，為微生物采煤技術提供實驗依據。

1　實驗材料及裝置

1．1　樣品采集

實驗所使用的煤樣取自河南省煤業化工集團有限責任公司鶴壁四礦下二疊統山西組下部的二¹煤，煤種為瘦煤，取樣方法分述如下：于回采工作面采集新鮮煤樣，迅速裝入充滿氮氣的干凈塑料袋內密封，帶回實驗室常溫保存。實驗所用菌種源為從煤層中流出的地層水，取樣方法如下：采用無菌的塑料桶在工作面排水溝中采集地層水，待桶內裝滿后迅速封閉，回到實驗室后置于4℃冰箱內保存。

1．2　煤樣制備

為了提高發酵反應的速度，需將煤樣進行預處理：①粉碎。將煤樣放入破碎機中，研磨制成60～80目之間的煤粉。②滅菌。將篩選出的煤樣放入高壓滅菌鍋內120℃滅菌30min，以排除外界微生物的干擾，然后將煤樣轉移至無菌的樣品袋中。③干燥。將樣品袋中的煤樣放入70℃的恒溫干燥箱中烘干至恒重，備用。

1．3　實驗材料分析

采用電感耦合等離子體質譜法(ICP-MS)對煤和地層水中部分重金屬元素進行檢測(表1)。

 

1．4　實驗裝置

使用250mL反應瓶，通過排水集氣法收集發酵產生的氣體。實驗裝置如圖l所示。

 

2　實驗方法

2．1　菌液富集

于錐形瓶中配制培養基，向瓶內充入高純氮氣驅替瓶子上部氧氣，將錐形瓶置于35℃恒溫培養箱內以富集地層水中的微生物。由于不同實驗的主要產氣菌群不同，對營養物質和pH值等介質環境的適應能力也不同，故需采用不同的培養基富集相應的菌種，即產氫實驗采用培養基Ⅰ，產甲烷實驗采用培養基Ⅱ。

2．2　單獨發酵產氫氣

2．2．1最適初始pH值的選擇

按培養基Ⅰ的配方向地層水中加入各營養物質，搖勻后將地層水置于35℃恒溫培養箱中4d以富集地層水中的發酵產氫菌。富集完成后，用2mol／L的NaOH和1mol／L的稀HCl調節富集后地層水菌液的初始pH值分別為5.5、6.0、6.5、7.0、7.5(誤差±0.1)；最后將煤與菌液放入250mL三角瓶內，比例為l5g煤+200mL菌液，搖勻后向三角瓶內充入高純氮氣以驅替反應瓶上部空間的氧氣，連接產氣裝置并置于35℃恒溫培養箱中。

2．2．2最適EDTA二鈉濃度的選擇

按培養基工的配方向地層水中加入各營養物質后，分別向各瓶地層水中添加金屬離子絡合劑EDTA二鈉，使其在地層水中的濃度分別為0、1.0g／L、l.5g／L、2.0g／L、2.5g／L、3.0g／L、4.0g／L；調節各瓶地層水的初始pH值在7.0左右，然后在35℃下富集地層水中發酵產氫菌4d；調節富集后地層水菌液的pH值為6.0左右，連接好產氣裝置，研究不同梯度EDTA二鈉對產氫的影響。

2．3　單獨發酵產甲烷

采用以下3種實驗方案，研究使用不同接種物時甲烷產率的大小(麥2)，白腐菌液由河南理工大學生物技術實驗室提供。

 

2．4　連續產氫產甲烷最適條件實驗

以發酵產氫后的廢料為實驗材料，通過調節pH值和補加新鮮地層水來研究產氫后連續產甲烷的可行性；以產氫階段結束后不進行任何處理的樣品，即方案一中的樣品為對照組。在方案二和方案三中，為避免發酵液的pH值過低而造成反應體系中產甲烷菌死亡，在產氫高峰期過后(第4天)便開始向反應瓶內注射堿液或補充地層水，并調節各個樣品的pH值，密封后開始發酵，使產甲烷菌利用發酵產氫菌的代謝產物(如小分子酸類、二氧化碳和氫氣等)產出甲烷。具體方法如下。

2．4．1方案一

15g煤+200mL富集后地層水菌液，分別調節樣品初始pH值為5.5～7.5，于35℃培養箱內開始發酵，待產氫發酵徹底完成后(第20天)換上新的集氣瓶，觀測瓶內有無新的氣體產生。

2．4．2方案二

1)產氫階段：15g煤+200mL富集后地層水菌液，并調節樣品的初始pH值在7.5左右，于35℃條件下產氫發酵4d。

2)產甲烷階段：為保證厭氧狀態，在厭氧手套箱內向上述反應瓶中注入2mol／L的稀NaOH溶液，使反應瓶內的pH值在7.5左右，連接產氣裝置后于35℃恒溫箱內開始發酵。

2．4．3方案三

1)產氫階段：7.5g煤+100mL富集后地層水菌液，并調節樣品的初始pH值在7.5左右，于35℃條件下厭氧發酵4d。

2)產甲烷階段：同樣的，在厭氧手套箱內向上述反應瓶中補加100mL新鮮地層水，并用2mol／L的稀NaOH溶液調節反應瓶內的pH值在7.5左右，連好產氣裝置后于35℃恒溫箱中開始發酵。

2．5　分析項目及方法

1)總產氣量測定：用量筒測量儲水瓶中的水量，以此反映產氣量。

2)氣體組分及濃度測定：氣相色譜檢測儀，TCD檢測器，5A硅膠柱，柱溫50℃，檢測器溫度100℃，熱絲溫度150℃，載氣為Ar，手動進樣，進樣量為lmL。

3)氫氣產率(mL／g煤)：除去空白樣所產氫氣，用單位質量煤產生的純氫氣量來表示。

4)甲烷產率(mL／g煤)：計算方法同氫氣。

3　實驗結果分析

3．1　初始pH值對產氫的影響

所有樣品在開始發酵后的第4天左右就達到產氣高峰，隨后產氣速率開始下降，到第8天左右之后幾乎不再產氣。發現在不同的初始pH值條件下，煤均可被微生物降解生成氫氣(圖2)。隨著初始pH值的升高，樣品的總產氣率和氫氣產率呈現先升高后降低的趨勢，且當初始pH值為6.0時，總產氣率最高，氫氣產率也最大。這說明在本實驗條件下，發酵產氫最適的初始pH值在6.0左右。所有樣品中均未檢測到甲烷。

 

3．2　EDTA二鈉濃度對產氫的影響

在對地層水中的發酵產氫菌富集后，各地層水菌液的pH值隨著培養基中EDTA二鈉濃度的增加呈現逐漸增大的趨勢(圖3)。這說明EDTA二鈉具有延緩菌液的pH值降低的作用。但是EDTA二鈉本身含有4個羧基，其溶于水后顯酸性，且EDTA二鈉的性質穩定，在酸性條件下不具有生物可降解性^[15-17]，這就排除了EDTA二鈉本身的影響。

 

因此，推測pH值升高的主要原因是地層水中微生物群落的代謝過程受EDTA二鈉的影響，其具體機理還有待深入研究。

產氫發酵結束后，測試各樣品在不同EDTA二鈉濃度下的產氣結果(圖4)。可見添加EDTA二鈉的樣品，其總氣體產率和氫氣產率均遠高于不含EDTA二鈉的樣品，且隨著EDTA二鈉用量的增加，總產氣率和氫氣產率大致呈先增后減的趨勢，并在EDTA二鈉濃度為2.0g／L時達到最大值。這說明在本實驗條件下，產氫最適宜的EDTA二鈉濃度為2.0g／L。EDTA二鈉的作用主要在以下兩點：①由于煤和地層水中存在重金屬元素(表1)，會對發酵體系中的微生物造成毒性抑制，EDTA二鈉可以絡合一部分重金屬，從而減輕了重金屬的抑制效應；②EDTA二鈉還可以脫除煤中的Ca²⁺、Fe³⁺和Al³⁺等多價金屬陽離子，從而使煤的生物溶解力增強^[18]。

 

在所有絡合物當中，堿金屬離子(Na⁺、K⁺)的配合物最不穩定；堿土金屬離子(如Be²⁺、Mg²⁺、Ca²⁺、Sr²⁺、Ba²⁺)和Ag⁺絡合物較穩定，lgK穩＝8～ll。過渡元素、稀土元素(如Fe²⁺、Co²⁺、Ni²⁺等)及Al³⁺絡合物穩定，lgK穩＝l5～19；3、4價金屬離子和Hg²⁺離子的絡合物最穩定，lgK穩>20。當使用較少量的EDTA二鈉時，由于絡合物穩定性的不同，EDTA二鈉優先與K穩較大的金屬形成絡合物，如Cr³⁺、Hg²⁺、Cu²⁺等，從而減輕了重金屬對微生物的抑制，提高了產氣量；當EDTA二鈉用量增加時，一些對微生物生長有利的金屬離子開始被絡合，如Fe²⁺、Co²⁺、Ni²⁺等，導致產氣量反而減少。

所有樣品中均未檢測到甲烷，因為產甲烷菌生長的pH值范圍為6.0～8.0，超出此pH值范圍時生長受到強烈抑制^[19-20]。在產氫發酵過程中，發酵產氫菌在產生氫氣的同時也產生大量酸性物質，如丙酮酸、乙酸、丙酸、丁酸等，使反應體系的pH值迅速降低(圖3)，進而對產甲烷菌的生長代謝造成抑制。此外，產甲烷菌生長緩慢、世代周期長^[4]；而產氫菌種類繁多、生長迅速，且產氫發酵過程較為短暫^[21-23]，導致了產氫過程中體系內的產甲烷菌不能大量繁殖，這也是產氫結束后在氣相產物中沒有檢測到甲烷的原因之一。

3．3　不同接種物對甲烷產率的影響

單獨發酵產甲烷工藝大約在第15天后才開始有甲烷產生，產氣持續時間約為30d，本實驗于第35d測試各樣品的產氣結果(表3)。

 

可見，以新鮮地層水為接種物時的甲烷產率最低，僅有0.5mL／g；用培養基Ⅱ對地層水中的微生物富集之后，再作為接種物時甲烷產率有所提高，可達8.0mL／g；以培養基Ⅱ富集菌種之后的地層水和白腐菌液的混合菌液為接種物時，甲烷產率最大，達到l2.6mL／g。這是由于煤是大分子有機物，必須被發酵水解菌等微生物降解成小分子有機物(如揮發性脂肪酸、甲醇等)后才可以被產甲烷菌利用生成甲烷。因此，以新鮮地層水為接種物時，由于接種物中含有的菌落數目較少，微生物對煤的降解速率較低，產氣量小。當使用經富集處理后的地層水為接種物時，原地層水中的發酵菌等微生物被富集、數量增多，加快了對煤基質的利用率，從而提高了甲烷產率。當以富集處理過的地層水和白腐菌液為接種物時，由于白腐菌可將煤降解為小分子物質^[24-25]，因而此時獲得的甲烷產率最高。

3．4　產氫廢料再產甲烷的產氣結果

產氫廢料的產甲烷反應啟動較慢，大約在第35天才開始有氣體產生，且產氣速率遠比產氫階段要慢，持續時間較長，直到第55天后才停止產氣。第65天測試各個集氣瓶中的氣體組分(表4)。所有樣品中均未檢測到氫氣。

 

可見，方案一在產氫完畢后不能再繼續產甲烷，而方案二和方案三均可實現產氫后再連續產甲烷，且方案二的甲烷產率要遠遠高于方案三。方案一未產甲烷主要是因為在富集發酵產氫菌以及厭氧發酵產氫的過程中，發酵產氫菌生成了大量的酸性物質，使反應液的pH值過低(圖3)，從而抑制了產甲烷菌的活性，甚至使其死亡；方案二是由于在產氫結束后調整了反應液的pH值至中性范圍內，使得反應體系中的產甲烷菌被激活，從而大量繁殖并產生甲烷；方案三也產生了一定量甲烷，但其甲烷產率明顯低于方案二，是因為向反應液中直接補加新鮮地層水這種處理方式使得原反應體系中的有機物和無機物的濃度降低，產甲烷菌等微生物對營養物質的可獲得性降低，從而降低了產甲烷菌等微生物的代謝活性。

3．5　兩種產甲烷方案的對比

相比于單獨發酵產甲烷工藝，連續產氧產甲烷工藝所獲得的甲烷濃度提高了9.4％，甲烷產率提高了1.1倍，可燃氣體(氫氣和甲烷)總產率提高了2.2倍(表5)。這說明產氫后再產甲烷這一發酵工藝對煤基質的利用率更高，產甲烷效果更好。

 

相比于單獨發酵產甲烷工藝，產氫后再產甲烷工藝多了一個產氫階段。在產氫階段內，發酵產氫菌在產生氫氣的同時還分泌出乙酸、丙酸、丁酸等物質，這些物質均可直接被產甲烷菌用來合成自身物質并產生甲烷。單獨發酵產甲烷時，由于沒有對發酵產氫菌進行富集培養，且發酵時的初始pH值較高(一般大于7.0)，而產氫菌適宜生長的pH值較偏酸性，所以此種工藝條件下反應體系內部產氫菌的活性較低，不能生成足夠多的乙酸、丙酸等物質供產甲烷菌利用。

4　結論

煤連續產生物氫和甲烷是一個全新的研究領域，是對微生物采煤方法的重要補充。本次實驗分別研究了煤制生物氫氣、煤制生物甲烷和連續產氫產甲烷的最佳條件，實現了煤制生物氫氣和甲烷的可控性。pH值是控制產氫以及產甲烷的一個重要因素，發酵產氫最適宜的初始pH值在6.0左右，產甲烷pH值則在7.5左右。重金屬對產氫的影響較為嚴重，采用EDTA二鈉絡合一部分重金屬，可顯著提高氫氣產率。產氫廢料再發酵產生的甲烷遠遠高于單獨的產甲烷發酵時所產生的甲烷，此時所獲得的甲烷濃度提高了9.4％，甲烷產率提高l.1倍，產生的可燃氣體(氫氣與甲烷)總量提高了2.2倍。

煤連續產生物氫和甲烷充分利用了煤基質，不僅獲取了甲烷，而且獲取了更為潔凈的氫氣。通過極端微生物的馴化培養，將其注入采空區，使之將一部分殘煤轉化為潔凈能源被利用是一個非常有潛在價值的研究領域，因為采空區的殘煤、未采的薄煤層以及巖層中的分散有機質都可作為微生物的作用對象。如果這一技術取得突破，中國的能源結構將會發生重大調整，大氣環境質量將得到根本改善。

 

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本文作者：蘇現波  陳鑫  夏大平  司青

作者單位：河南理工大學能源科學與工程學院

  華亭煤業集團有限責任公司